地球-65，蜘蛛女格温（海莉·斯坦菲尔德 Hailee Steinfeld 配音）因为好友彼特之死而充满愧疚，而父亲对蜘蛛侠的误解也让她倍感焦虑。某次行动中，格温结识了来自其他宇宙的同伴米圭尔·奥哈拉和杰西卡·德鲁。从他们口中得知，为了防止多元宇宙进一步崩坏，米圭尔策划成立了由蜘蛛侠中的精英组成的突击队。格温受邀加入他们，并利用时空穿梭的机会来到了地球-1610，见到久违的迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）。此时的迈尔斯和父母关系紧张，他憧憬格温，渴望加入突击队又遭到拒绝。
随后迈尔斯又听到一个可怕的消息，每一个宇宙中，失去至亲正是所有蜘蛛侠的可悲宿命……
宫野真守 樱井孝宏 花泽香菜 杉田智和 梶裕贵 诹访部顺一 三宅健太 堀内贤雄 中井和哉 山路和弘 山本兼平 上田丽奈 小泽亚李 柳田淳一 石谷春贵 藤井隼 佐佐健太 辻井健吾 小松奈生子 洲崎绫 谷口淳志 山本满太 山村勇人 须崎成幸 滨田洋平 高桥伸也 田岛章宽
伊万·卡马拉斯 加布里瑞拉·哈默里 佐兰·马克兰兹 乔鲍·马顿 保罗‧贝兰托尼 马特·戴维尔 卡塔琳‧东比 亨利‧格兰特 彼得·林卡 马泰‧梅萨罗什 加博尔·纳吉帕尔 维吉尼亚‧普罗德
安格瑞·赖斯 山姆·尼尔 Sharnee Tones Grant Denyer Lucy Durack 弗兰克·伍德利 Ricard Cussó Karl Stefanovic Alison Langdon Richard Wilkins Ryan Renshaw